Séquençage/NGS

Principe : 

Le séquençage de l’ADN est le processus consistant à déterminer l’ordre précis des nucléotides dans une molécule d’ADN. Il comprend tout procédé ou technologie utilisés pour déterminer l’ordre des quatre bases (Adénine, Guanine, Cytosine, Thymine) le long de la molécule d’ADN. Cette technologie est intéressante pour des virus inconnus ou encore des souches virales divergentes. Il existe différentes techniques de séquençage : le séquençage enzymatique (Méthode de Sanger, méthode chimique de Maxam et Gilbert) et séquençage haut débit.

Séquençage historique de Sanger :

Séquençage haut débit - NGS (Next-Generation Sequencing) :

Ils existent plusieurs technologies qui reposent sur plusieurs étapes communes :

• Fragmentation enzymatique de l'ADN
• Préparation d'une banque d'ADN par ligation d'adaptateurs. Ceci permet une amplification par PCR.
• Amplification clonale : Elle peut être réalisée soit par une émulsion huile/eau suivie de la création de microréacteurs et d’une ePCR (emulsion PCR) ou par une amplification sur phase solide suivie d’une bridge PCR. 
• Séquençage. Chaque technologie possède sa propre méthode de séquençage : 
  • Pyroséquençage : Après fragmentation, l’ADN subit une amplification par ePCR (PCR en émulsion). Cette technique permet de réaliser dans un seul tube plusieurs millions de réactions indépendantes. Le mélange est ensuite déposé sur une plaque. Chaque emplacement contient une seule molécule d’ADN amplifiée. Le séquençage est initié base par base. Il y a ensuite révélation à l’aide d’une réaction chimioluminescente. 
  • Séquençage à l’aide de terminateurs réversibles : La réaction de séquençage a lieu sur un support solide. Un mélange contenant toutes les bases associées chacune à un fluorophore différent est incorporé. L’extrémité des bases est protégée pour bloquer la PCR de manière réversible. Après identification de la première base, il y a clivage des fluorophores et les étapes d’incorporation, de détection et d’identification sont répétées. 
  • Séquençage par ligation : La première étape d’amplification de cette méthode est identique à celle du pyroséquençage mais la stratégie de séquençage est très différente. La réaction de séquençage repose sur un système complexe de cycles de ligation séquentielle d’oligonucléotides et de clivage. Après détermination d’une paire de bases, identifiable par un fluorophore, l’oligonucléotide ligué est enlevé et ce processus est répété plusieurs fois.
• Détection des signaux fluorescents ou luminescents et conversion en séquence

Caractéristiques des différentes méthodes de séquençage accessible en routine en France :

Les informations présentées sont issues des fiches rédigées par des élèves ingénieurs de la spécialisation protection des cultures de l'ENSAIA dans le cadre des actions de l'axe 2 du RMT VEGDIAG.